綠色熒光蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

更新時間：2023-09-06 點擊次數(shù)：1888

綠色熒光蛋白（GFP）是一種由約238個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，能被藍光到紫外光激發(fā)而發(fā)出綠色熒光。雖然許多其他海洋生物也有類似的綠色熒光蛋白，但傳統(tǒng)上，綠色熒光蛋白（GFP）是指首先從維多利亞水母中分離出來的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)是由 Osamu Shimomura 等人首先發(fā)現(xiàn)的。 1962年在水母維多利亞。這個發(fā)光過程還需要發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白的幫助，而這種發(fā)光蛋白可以與鈣離子相互作用。

維多利亞多管發(fā)光水母中發(fā)現(xiàn)的野生型綠色熒光蛋白，395nm和475nm分別是最大和第二大激發(fā)波長，其發(fā)射波長峰值在509nm，處于可見光譜中綠光偏藍的位置。綠色熒光蛋白的熒光量子產(chǎn)率(QY)為0.79。從海堇中獲得的綠色熒光蛋白僅在498 nm處具有較高的激發(fā)峰。

在細胞生物學和分子生物學中，綠色熒光蛋白（GFP）基因經(jīng)常被用作報告基因。綠色熒光蛋白基因也可以克隆到脊椎動物（例如：兔子）中進行表達，并用于演示假設(shè)的實驗方法。通過基因工程技術(shù)，可以將綠色熒光蛋白（GFP）基因轉(zhuǎn)移到不同物種的基因組中，并在后代中持續(xù)表達。現(xiàn)在，綠色熒光蛋白（GFP）基因已被引入并在許多物種中表達，包括細菌、酵母和其他真菌、魚類（例如斑馬魚）、植物、蒼蠅，甚至人類等哺乳動物細胞。

發(fā)展歷程

1962年，據(jù)報道，科學家從發(fā)光的水母水母中提取了具有生物發(fā)光特性的蛋白質(zhì)。 20世紀70年代，生物發(fā)光現(xiàn)象有了一些新的發(fā)展。一些科學家研究了水母屬生物發(fā)光系統(tǒng)中的分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移。 20世紀90年代初，科學家克隆了GFP cDNA并研究了其表達的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)gfp 10 cDNA編碼了238個氨基酸的肽段。對A. victoria GFP基因的克隆進行研究，發(fā)現(xiàn)GFP基因上存在3個限制性酶切位點。這對于后來科學家了解其結(jié)構(gòu)有很大幫助。
1994 年 2 月，M. Chalfie 等人。等人創(chuàng)造性地分別在大腸桿菌和秀麗隱桿線蟲細胞中表達GFP，并得出結(jié)論：由于GFP發(fā)光不需要其他底物或輔因子，因此GFP的表達可用于監(jiān)測體內(nèi)基因表達和蛋白質(zhì)定位。此后的一段時間里，無數(shù)的研究人員致力于GFP相關(guān)的研究。在 M. Chalfie 報告的過去一個月左右，Tsuji 等人。在大腸桿菌中融合表達GFP蛋白，并且在生物體中GFP的激發(fā)和發(fā)射光譜與自然條件下沒有顯著差異。由于GFP在生物體中的熒光強度不夠強，很難應(yīng)用于實際科學研究。 1995 年，Tsien 等人。提高了GFP的發(fā)光強度，極大地促進了GFP在生物研究中的應(yīng)用。然后在 1996 年 8 月，F(xiàn). Yang 等人。分析了 GFP 的分子結(jié)構(gòu)。 GFP蛋白呈桶狀，由11個β-折疊構(gòu)成外圍，內(nèi)部有α-螺旋，桶的末端是一些不規(guī)則的卷曲。同年 9 月，Tsien 等人。分析了GFP的晶體結(jié)構(gòu)并闡明了其發(fā)光原理。還有科學家創(chuàng)造突變體來篩選更好的GFP，比如pH敏感的GFP、專門用于植物細胞研究的GFP等等。除了優(yōu)化GFP之外，許多科學家還開拓了思路，將GFP蛋白的應(yīng)用拓展到了很多研究領(lǐng)域。 2002年，David A. Zacharias等人將GFP蛋白應(yīng)用于膜蛋白的研究。同年，GFP蛋白甚至被制成Zn生物探測器。

結(jié)構(gòu)

野生型綠色熒光蛋白最初是一條 238 個氨基酸的肽鏈，約 25KDa。然后按照一定的規(guī)則，11個β-折疊圍繞外周形成一個圓柱形的柵欄；在圓柱體中，α-螺旋將發(fā)色團幾乎精確地固定在中心。發(fā)色團被中心包圍，可以避免極化的水分子、順磁氧分子或順反異構(gòu)體與發(fā)色團，導(dǎo)致熒光猝滅。

熒光是熒光蛋白最特殊的特征，其中發(fā)色團起著主要作用。 α-螺旋上的65、66和67個氨基酸——絲氨酸、酪氨酸和甘氨酸經(jīng)過環(huán)化、脫氫等形成發(fā)色團。有趣的是，發(fā)色團的形成過程是由外圍柵欄上的殘留物催化的，而底物只需要氧氣。這表明GFP在不同物種中廣泛應(yīng)用的潛力：它可以在不同物種中獨立表達為功能蛋白，而不需要額外的因子。但具體流程仍在討論中。
發(fā)色團上的共軛π鍵可以吸收激發(fā)光能量，并在短時間后，以較長波長的發(fā)射光釋放能量，產(chǎn)生熒光。

應(yīng)用

由于熒光蛋白可以在后代中穩(wěn)定遺傳，并且可以根據(jù)啟動子特異性表達，因此在定量或其他實驗中已逐漸取代傳統(tǒng)的化學染料。更多的是，熒光蛋白已經(jīng)轉(zhuǎn)化為不同的新工具，不僅為解決問題提供了新思路，還可能帶來更有價值的新問題。

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