小分子藥物聚乙二醇化方法

更新時(shí)間：2023-10-08 點(diǎn)擊次數(shù)：2597

聚乙二醇(PEG)是乙二醇的聚合物，相對(duì)分子質(zhì)量為200～8000或以上。由重復(fù)的乙氧基組成，不僅具有良好的水溶性，而且易溶于苯、乙腈、乙醇等有機(jī)溶劑。 PEG分子的特點(diǎn)如下：

①低分散性：相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）小于5000的分散性為1.01，分子量（Mr）大于5000的分散性為1.1，具有較寬的范圍。分布和更大的選擇性；
②兩親性：既溶于有機(jī)溶劑又溶于水；
③無毒：研究表明大于1000的聚乙二醇無毒，已用于各種食品、化妝品和藥品中；
④ 可生物降解：聚乙二醇在體內(nèi)直接消除，結(jié)構(gòu)不發(fā)生任何變化。分子量小于20000的代謝物可以通過腎臟代謝，較大分子可以通過消化系統(tǒng)代謝。

聚乙二醇化藥物的特點(diǎn)

大多數(shù)蛋白質(zhì)藥物、多肽藥物、化學(xué)藥物都伴有一些自身無法克服的問題，如作用時(shí)間短、免疫原性大、副作用大等。 PEG呈中性、無毒，具有很好的理化性質(zhì)和良好的生物相容性，是美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于體內(nèi)注射藥物的少數(shù)化學(xué)品之一。因此，通過化學(xué)方法將活化的聚乙二醇與蛋白質(zhì)、肽、小分子藥物和脂質(zhì)體連接，即對(duì)藥物分子進(jìn)行聚乙二醇化，可以有效提高藥物分子的生物半衰期，降低其毒副作用。可以減少影響。其中，研究最多的是蛋白質(zhì)的PEG修飾。與未修飾的蛋白質(zhì)藥物相比，聚乙二醇化的蛋白質(zhì)藥物具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）生物活性更強(qiáng)；
（2）脂質(zhì)體對(duì)腫瘤有更強(qiáng)的被動(dòng)靶向作用；
(3)較長(zhǎng)的半衰期；
(4)降低最大血藥濃度；
(5)血藥濃度輕微波動(dòng)；
(6)酶促降解少；
(7)免疫原性和抗原性較低；
(8)毒性較小；
(9) 溶解性更好；
(10)減少用藥次數(shù)；
(11)提高患者依從性，改善生活質(zhì)量，降低治療費(fèi)用。

聚乙二醇化方法

鑒于聚乙二醇化對(duì)藥物性質(zhì)的巨大影響，聚乙二醇化已成為藥物開發(fā)和提高已上市藥物療效的重要途徑。因此，如何進(jìn)行PEG化就成為重中之重。

首先，需要選擇合適的PEG進(jìn)行分子修飾。修飾劑的選擇主要考慮以下5個(gè)方面：

（1）選擇PEG相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）的確定應(yīng)同時(shí)考慮生物活性和藥代動(dòng)力學(xué)因素。應(yīng)用太大的聚乙二醇化蛋白藥物會(huì)導(dǎo)致藥物失去大部分生物活性。當(dāng)使用低Mr（<20000）聚乙二醇化蛋白質(zhì)藥物時(shí)，修飾后的蛋白質(zhì)藥物與原型藥物相比，生物活性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)沒有本質(zhì)變化。因此，一般選擇40000-60000范圍內(nèi)的PEG作為修飾。
(2)修飾位點(diǎn)的選擇應(yīng)基于對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的分析。選擇不與受體結(jié)合的蛋白質(zhì)表面殘基作為修飾位點(diǎn)，使得修飾后的蛋白質(zhì)能夠保留較高的生物活性。常見的修飾位點(diǎn)有氨基修飾、羧基修飾和硫醇修飾；
(3) PEG修飾劑與氨基酸反應(yīng)的特異性取決于修飾劑的化學(xué)性質(zhì)和修飾位點(diǎn)的選擇。
(4)PEG修飾劑的水解穩(wěn)定性和反應(yīng)活性取決于活化基團(tuán)的穩(wěn)定性和修飾反應(yīng)條件尤其是pH值的控制。一般來說，PEG修飾劑反應(yīng)活性高，因此穩(wěn)定性較差，容易水解；
(5)聚乙二醇化蛋白的活性、毒性和抗原性與聚乙二醇修飾的大小和類型有關(guān)。一般情況下，隨著PEG相對(duì)分子量的增加，蛋白質(zhì)活性的損失逐漸增加。此外，不同的PEG修飾劑對(duì)蛋白質(zhì)生物活性的影響也不同。

其次，激活PEG。聚乙二醇化蛋白質(zhì)主要是通過PEG末端羥基與蛋白質(zhì)氨基酸殘基反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。 PEG末端羥基活性較差，必須用活化劑活化才能在體內(nèi)溫和條件下共價(jià)修飾蛋白質(zhì)。常見的PEG活化方法有：

(1)羰基二咪唑法：該方法首先用于多肽的合成，并已被證明是形成酰胺鍵的良好試劑。

羰基二咪唑活化PEG

(2)N-羥基琥珀酰亞胺法： (a)活化N，N-琥珀酰亞胺碳酸酯。該反應(yīng)需要在無水條件下進(jìn)行。 (B) 活化琥珀酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺。該方法得到的聚乙二醇具有較高的活性。最好在非水環(huán)境中進(jìn)行蛋白質(zhì)偶聯(lián)。

N,N-琥珀酰亞胺碳酸酯活化的 PEG

琥珀酸酐和 N-羥基琥珀酰亞胺活化的 PEG

(3)氰尿酰氯法：氰尿酰氯又稱三氯嗪(TST)，是一種對(duì)稱雜環(huán)化合物。 David 使用 TST 與聚乙二醇上的羥基發(fā)生反應(yīng)。只有一個(gè)氯原子被取代，其他氯原子與蛋白質(zhì)氨基反應(yīng)。

氰尿酰氯活化的 PEG

(4)光氣活化法：Kurfuerst提到了由N-羥基琥珀酰亞胺鉀鹽、硝基苯酚、三氯苯酚與光氣反應(yīng)制備活化聚乙二醇的方法。激活分為兩個(gè)步驟，如下圖所示。

PEG的光氣活化

(5)聚乙二醇對(duì)蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾。磺基特異性修飾的常見PEG活化方法如下圖所示。

硫醇激活的 PEG 的特異性修飾

(6)連接酶位點(diǎn)的聚乙二醇：除了傳統(tǒng)的化學(xué)修飾方法外，還可以通過酶催化等其他方式實(shí)現(xiàn)修飾，以G-TGase為例。

酶聯(lián)聚乙二醇

最后選擇合適的蛋白質(zhì)氨基酸殘基位點(diǎn)或小分子藥物位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾。用活化的PEG對(duì)合適的蛋白質(zhì)氨基酸殘基進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾可以提高天然蛋白質(zhì)的功效。蛋白質(zhì)藥物PEG修飾技術(shù)最大的問題是無法實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性修飾，修飾產(chǎn)物不均一，給分離純化帶來很大困難，也極大阻礙了臨床應(yīng)用。根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸性質(zhì)和PEG衍生物的特點(diǎn)，科學(xué)家在使用PEG進(jìn)行修飾時(shí)，選擇不與受體結(jié)合的蛋白質(zhì)表面殘基作為修飾位點(diǎn)。這樣，修飾后的蛋白質(zhì)藥物除了具有聚乙二醇化帶來的優(yōu)異性能外，還具有較高的生物活性。目前上市藥物中常見的修飾位點(diǎn)包括氨基、羧基、磺基、二硫基、糖基以及非極性氨基酸的一些特定位置。