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分子克隆是分子生物學中用于組裝重組DNA分子的一組實驗方法。
基于質粒的克隆包括 4 個主要步驟：
插入 DNA 制備
載體DNA制備
插入片段與載體的連接
轉化為感受態細胞
在下面的示例中，我們將描述如何使用 SgfI 和 MluI 將目標插入片段亞克隆到載體中。
對含有插入片段的載體進行限制性消化
用相應的限制性內切酶消化含有插入片段的載體 DNA。對于我們的示例，使用的限制性位點是 SgfI 和 MluI 位點。 OriGene 擁有全基因組 cDNA 表達載體。
在瓊脂糖凝膠上運行消化的插入 DNA 以檢查大小并進行凝膠內純化。
OTI-TIP：在瓊脂糖凝膠上運行純化的消化插入片段以確認濃度。濃度將進一步有助于建立連接。
從模板進行 PCR 擴增
如果無法用兼容的限制性位點切割插入片段，則可以使用 PCR 來擴增插入片段，使其具有目標序列側翼的所需克隆位點。
設計包含目標序列側翼所需克隆位點的引物。免費的在線軟件程序可用于設計引物。如果手動設計，我們建議最小長度約為20bp，GC含量為40-60%，Tm為60-65°C。
通過 PCR 擴增模板中的插入 DNA。使用 PCR 純化試劑盒純化產物。
用限制性內切酶消化 PCR 產物。在瓊脂糖凝膠上運行消化的 PCR 并純化正確大小的 PCR 帶。
OTI-TIP：在瓊脂糖凝膠上運行純化的 PCR 插入片段以確認濃度。濃度將進一步有助于建立連接。
選擇適合您的包含多個克隆位點 (MCS) 的克隆載體。 OriGene 擁有超過120 種哺乳動物表達載體，包括病毒和非病毒形式。
如果需要更多的載體DNA，可以使用熱休克或電穿孔方法轉化至大腸桿菌感受態細胞，例如DH5 alpha。
用與插入序列（例如 SgfI 和 MluI 位點）兼容的限制性酶消化 3-5 ug 載體。將限制性消化酶在 37°C 下孵育 1 小時。
OTI-TIP：可能需要更長的孵育時間以確保載體全消化，但不要超過 3 小時。
OTI-TIP：為防止載體自連接，請用堿性磷酸酶在 37°C 下將消化載體的 5' 末端去磷酸化 30 分鐘。
為了減少未切割的載體質粒背景，我們建議在瓊脂糖凝膠上運行消化的載體，然后純化線性載體。
OTI-TIP：在瓊脂糖凝膠上運行純化的消化載體以確認濃度。濃度將進一步有助于建立連接。
為了成功連接，您可以使用載體：插入片段摩爾比為 1:3。
OTI-TIP： 1:1 和 1:10 之間的載體：插入片段比例也可用于進一步優化連接反應。
要確定自連接產生的任何背景克隆，請設置不含插入 DNA 的對照連接。
在 16 oC 下孵育過夜（或根據連接試劑盒中的方案）。
通過電穿孔或熱休克方法將 1-2 uL 連接反應轉化至大腸桿菌感受態細胞中。
OTI-TIP：如果插入片段有毒或不穩定，則可以使用專門允許這些插入片段成功擴增的感受態細胞。
轉移至 SOC 培養基中以復活轉化的細胞。在 37°C 下攪拌 SOC 介質 1-2 小時。
將混合物接種到裝有抗生素平板的 LB 上，并在 37°C 下孵育過夜。
OTI-TIP：對于某些有毒插入物，可能需要較低的溫度和較長的孵育時間。較小的菌落可能是正確的克隆。
篩選帶有目標插入序列的質粒的集落。通過消化、PCR 擴增和測序確認
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