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蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液適用于 CuAAC 與蛋白質(zhì)的反應(yīng)，可保護(hù)生物分子免受活性氧的損害。該反應(yīng)可用于具有炔烴或疊氮基團(tuán)的蛋白質(zhì)，以及用疊氮基團(tuán)代謝標(biāo)記的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物的組分。
疊氮化物與末端炔烴綴合，形成五元雜環(huán)（1,2,3-三唑）。這兩個(gè)基團(tuán)（疊氮基和炔烴）在天然生物分子中都極為罕見，因此該反應(yīng)具有高度特異性，可以有效地處理各種任務(wù)。
該反應(yīng)在銅 (I) 化合物存在下進(jìn)行，幾乎不依賴于 pH 值。蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液針對(duì)蛋白質(zhì)操作進(jìn)行了優(yōu)化，含有銅 (II) 鹽（催化活性銅 (I) 化合物的穩(wěn)定前體）、醋酸三乙銨 pH 6.8、水溶性 THPTA 配體和氨基胍。建議使用新鮮配制的 抗壞血酸溶液減少銅(II)。蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液中的 THPTA 配體通過穩(wěn)定銅 (I) 的催化活性化合物來加速反應(yīng)。 THPTA 配體的存在還允許在水介質(zhì)（無有機(jī)溶劑）中進(jìn)行蛋白質(zhì)標(biāo)記，并且由于銅 (I) 氧化程度的穩(wěn)定，最大限度地減少活性氧 (RAS) 的產(chǎn)生，并防止它們通過氧化組氨酸、蛋氨酸來損壞蛋白質(zhì)和半胱氨酸。蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液中的氨基胍可防止化學(xué)反應(yīng)性醛（脫氫抗壞血酸水解產(chǎn)物）與精氨酸、N 末端半胱氨酸和賴氨酸的側(cè)鏈結(jié)合。
對(duì)于此反應(yīng)，您將需要無疊氮鈉緩沖液中的炔烴或疊氮化物修飾的蛋白質(zhì)、疊氮染料或 炔烴、1.5х蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液和抗壞血酸。建議在惰性氣體（氮?dú)饣驓鍤猓┫聢?zhí)行步驟 6 至 9。
我們推薦以下方案用于修飾蛋白質(zhì)與染料衍生物的綴合：
根據(jù)要使用的修飾蛋白的量確定總反應(yīng)體積：
！炔烴或疊氮化物修飾的蛋白質(zhì)溶液的體積不應(yīng)超過總反應(yīng)體積的1/3。
| 總反應(yīng)體積，μL | 蛋白質(zhì)含量 |
|---|---|
| 100 | 4至20納摩爾 |
| 200 | 20至40納摩爾 |
| 400 | 40至80納摩爾 |
| 600 | 80 至 600 納摩爾 |
使用下表計(jì)算標(biāo)記反應(yīng)的試劑體積：
| 試劑 | 體積，微升 | 原液濃度 |
|---|---|---|
| 染料疊氮化物或炔烴 | （蛋白質(zhì)含量 [nmol]）× 0.3* | 10 mM DMSO 或水 |
| 蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液 | （總反應(yīng)體積[μL]）×0.67 | 1.5倍 |
| 活化劑（抗壞血酸） | （總反應(yīng)體積[μL]）×0.02 | 50 mM 水中 |
| 水 | （總反應(yīng)體積 [μL] – 染料溶液體積 [μL] – 蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液體積 [μL] – 活化劑溶液體積 [μL]） | — |
* 染料過量可能會(huì)根據(jù)蛋白質(zhì)分子上疊氮化物或炔基的數(shù)量而變化。表中顯示的計(jì)算結(jié)果為 3 倍過量的染料。對(duì)于 1.5–10 倍過量的染料，將蛋白質(zhì)含量 (nmol) 乘以 0.15–1。但請(qǐng)記住，如果您使用不溶于水的疊氮化物或炔烴，則過量時(shí)它可能會(huì)從反應(yīng)混合物中沉淀出來。使用水溶性染料，例如磺化花青染料sulfo-Cyanine。
準(zhǔn)備 染料疊氮化物或炔烴（10 mM 溶于 DMSO 或水中，適用于水溶性炔烴和疊氮化物）和活化劑（抗壞血酸，50 mM 水溶液）的儲(chǔ)備溶液。
請(qǐng)記住，抗壞血酸在空氣中很容易氧化。僅使用新配制的活化劑溶液 （該溶液在 1 天內(nèi)穩(wěn)定）。要制備儲(chǔ)備溶液，請(qǐng)將 10 mg 抗壞血酸溶解在 1.1 mL 水中。
將蛋白質(zhì)標(biāo)記緩沖液添加到修飾的蛋白質(zhì)溶液中并渦旋。
添加計(jì)算體積的疊 氮化染料或炔烴儲(chǔ)備溶液，并再次渦旋均勻。
（推薦）對(duì)混合物進(jìn)行脫氣以除去氧氣。為此，將一次性移液器吸頭連接到塑料或硅膠管，該管連接到裝有惰性氣體（氬氣或氮?dú)猓┑臍馄康膲毫φ{(diào)節(jié)器。打開非常弱的氣流，放入管中，使其比液面高 3-10 毫米，避免接觸液體和管壁。氣流應(yīng)在液體中形成漩渦而不濺出液體。將保持在該位置 10-20 秒。
如果同時(shí)進(jìn)行多個(gè)標(biāo)記反應(yīng)，可以使用離心濃縮器進(jìn)行脫氣。為此，將管子放入濃縮器中，打開旋轉(zhuǎn)，打開真空 30-40 秒，然后關(guān)閉真空，同時(shí)向系統(tǒng)輸入端輸送惰性氣體。
添加活化劑溶液（抗壞血酸），然后用惰性氣體吹掃管幾秒鐘并關(guān)閉它。
渦旋溶液。
讓混合物在室溫下靜置 8-16 小時(shí)。
使用透析或尺寸排阻色譜分離染料-蛋白質(zhì)綴合物。
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