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對于 OD600測量時(shí)，穿過樣品的光被懸浮在樣品中的細(xì)胞向隨機(jī)方向散射。這種光散射是特定細(xì)胞大小和形狀以及細(xì)胞懸液密度的函數(shù)。此外，死細(xì)胞和細(xì)胞碎片可能會導(dǎo)致光散射。相同密度的不同細(xì)胞類型（例如每毫升細(xì)胞數(shù)）可能導(dǎo)致不同的 OD600值。
分光光度計(jì)的光學(xué)配置在特定儀器檢測到的光散射中起著重要作用。不同的 OD600當(dāng)在具有不同光學(xué)設(shè)置的分光光度計(jì)上測量時(shí)，將報(bào)告相同細(xì)菌培養(yǎng)物的值。一個(gè) OD600的 0.8 可以在另一臺儀器上報(bào)告為 0.5，而不會在任何一臺設(shè)備上出現(xiàn)錯(cuò)誤。
DeNovix DS-11 系列分光光度計(jì)/熒光計(jì)可使用 1 μL 微量模式（適合高密度培養(yǎng)物）或各種光程比色皿模式測量微生物培養(yǎng)物。
許多研究人員依賴靶標(biāo) OD600在收獲微生物細(xì)胞培養(yǎng)物或確定接種用于蛋白質(zhì)表達(dá)研究的培養(yǎng)物的正確密度時(shí)從文獻(xiàn)來源獲得的值。遺憾的是，這些目標(biāo)值可能不適合細(xì)胞類型和所用儀器的組合。建議將 OD600使用與 OD 相關(guān)的生長曲線根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定值600使用新分光光度計(jì)時(shí)每種細(xì)胞類型的板計(jì)數(shù)值。
DS-11 微量模式可實(shí)現(xiàn)更高的 OD600值使用其獲得特別的自動(dòng)路徑長度調(diào)整。請記住，微量和比色皿模式使用不同的光學(xué)配置，因此在比較使用兩種模式測量的值時(shí)，建立轉(zhuǎn)換因子可能很有用。
最好使用接近所需目標(biāo) OD 的測量值來確定因子600價(jià)值。酌情考慮稀釋。
可以確定一個(gè)等效因子，然后將其應(yīng)用于使用不同分光光度計(jì)進(jìn)行的測量。
下面的數(shù)據(jù)是一個(gè)例子，說明了在不同分光光度計(jì)上測量相同的光散射樣品如何導(dǎo)致不同的 OD600 測量值（表 1 和表 2）。
將 Formazin 4000NTU 濁度標(biāo)準(zhǔn)品 （Hach cat #246149） 稀釋 7.7 倍以產(chǎn)生初始儲備液。然后在水中進(jìn)行一系列 2 倍連續(xù)稀釋。使用一次性比色皿和 2 mL 的相應(yīng)稀釋度測量每種溶液，一式三份。未對 600 nm 測量值進(jìn)行基線校正。
Table 1: Mean OD600 Values; n=3
| Sample | Agilent 8453 | DS-11+ |
|---|---|---|
| Stock | 1.1588 | 0.8376 |
| Stock 1:2 | 0.5696 | 0.4245 |
| Stock 1:4 | 0.2794 | 0.2173 |
| Stock 1:8 | 0.1372 | 0.1125 |
| Stock 1:16 | 0.0684 | 0.0594 |
| Stock 1:32 | 0.0326 | 0.0310 |
| Stock 1:64 | 0.0140 | 0.0158 |
Table 2: Precision of Replicate Measurements; n=3
| Sample | Agilent 8453 % CV | DS-11+ % CV |
|---|---|---|
| Stock | 0.61% | 0.24% |
| Stock 1:2 | 0.82% | 1.15% |
| Stock 1:4 | 1.61% | 2.76% |
| Stock 1:8 | 0.63% | 1.92% |
| Stock 1:16 | 0.91% | 3.82% |
| Stock 1:32 | 5.03% | 8.58% |
| Stock 1:64 | 11.17% | 10.82% |
線性范圍
基于比色皿的儀器通常具有測得光程的外徑上限約為 1.5。外徑600如此高的值可能不足以覆蓋培養(yǎng)物的整個(gè)生長周期，并且在生長方面可能不是線性的。死亡期的培養(yǎng)物可能表現(xiàn)出不同的光散射行為，這可能會影響活細(xì)胞密度與測得的 OD 之間的相關(guān)性600值。
因此，必須仔細(xì)稀釋培養(yǎng)物，以便繪制整個(gè)生長曲線或確定測量值不再與活細(xì)胞密度線性相關(guān)的極限。
此外，盡管測得的 OD600值和特定像元密度在兩種不同儀器上的范圍可能重疊，線性線的斜率可能不同。表 1 中的數(shù)據(jù)如下圖所示（圖 1）作為此范式的一個(gè)例子。
當(dāng)使用轉(zhuǎn)換因子將數(shù)據(jù)從一臺儀器關(guān)聯(lián)到另一臺儀器時(shí)，可能需要對特定的 OD 范圍使用不同的因子來補(bǔ)償不同的斜率。
注意：盡管斜率不同，但兩種儀器的 R2 值均> 0.9999。
The OD600應(yīng)用程序允許用戶輸入一個(gè)細(xì)胞數(shù)因子，該因子將乘以測得的 OD600值來計(jì)算近似的細(xì)胞/mL 濃度。如前所述，OD600值取決于被采樣溶液中細(xì)胞的大小和形狀以及細(xì)胞密度。一個(gè) OD600值 1 可能等于大約 1 x108一種細(xì)胞類型的細(xì)胞，但僅等于 0.5 x108細(xì)胞。
要使用此功能，建議最初為每種細(xì)胞類型確定適當(dāng)?shù)募?xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)換因子。構(gòu)建 OD 的校準(zhǔn)曲線600值與瓊脂平板上生長的菌落形成單位的細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。確保在適當(dāng)時(shí)乘以稀釋因子。
酵母細(xì)胞通常比細(xì)菌細(xì)胞大。因此，OD600值 1 通常相當(dāng)于酵母細(xì)胞比細(xì)菌細(xì)胞少。
為確保最佳結(jié)果，以 OD 為目標(biāo)600對于微量和比色皿模式，應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定每種細(xì)胞類型的值。
比色皿模式（推薦）
微量模式
Formula Methods 應(yīng)用程序支持創(chuàng)建自定義方法和公式，包括用于測量 600 nm 以外波長下 OD 的方法和公式。例如，可以使用以下參數(shù)測量 650 nm 處的 OD：分析 nm = 650，基線 nm = 留空，最小 nm = 550，最大 nm = 700。
DeNovix DS-11 系列儀器能夠使用預(yù)配置的 OD 測量酵母和微生物培養(yǎng)物600應(yīng)用程序。
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